鸚形目性別核酸檢測試劑盒（帶內參，PCR-熒光探針法  

本試劑盒可對鸚鵡的羽毛、血液及組織等樣品中CHD-W保守基因進行擴增檢測，進而對鸚鵡性別進行鑒定。通過引入內源性內參可對核酸提取和擴增過程進行監測，確保檢測結果的準確性。  

產品內容：  

儲存條件：  

-20℃條件下保存，有效期至少12個月。  

實驗操作：  

1. 樣本制備（樣本制備區）  

1.1樣本要求：  

羽毛：采集胸部、腹部或腿部羽毛（含羽根部分）不少于5根，切勿使用自然脫落的羽毛。  

全血：使用EDTA作為抗凝劑，切勿使用肝素抗凝，要求使用新鮮全血，或在2~8℃不超過7天，或在-20℃條件下保存不超過3個月，應盡量避免反復凍融。  

組織：采取新鮮肌肉或器官組織（盡可能不使用皮或者筋膜等不易處理樣本）不超過100mg，使用200-500μL無菌水制備組織勻漿液，再進行后續樣本制備。  

1.2樣本制備：  

請參照三獅生物《動物基因組DNA快速提取試劑盒（PCR分析用）說明書》（貨號：DP202），或其他符合相關要求的核酸提取試劑盒/方法，對處理后的樣品進行核酸提取。提取的樣品核酸放置于冰盒中，并盡量及時進行檢測，4℃保存不超過7天或-20℃保存不超過6個月。  

2. 配制反應體系（加樣區）  

2.1 取出試劑盒中各組分，室溫條件下完全解凍，離心10秒，將管壁和管蓋內的液體離心至管底；按樣本數量（n+2）（即n個待檢樣本+1個陽性對照+1個陰性對照）配制反應體系，具體配制方法如下：分別吸取（（n+2）× 11.5μL CW反應液+（n+2）× 11.5μL CW預混液）加入潔凈離心管中，移液器吹吸充分混勻，分裝至PCR管中，每孔23μL，放在冰盒中備用。  

2.2 然后向反應液中依次添加2μL陰性對照、提取的樣本核酸和CW陽性對照，蓋好管蓋，做好記錄，每個反應總體積為25μL。充分混勻，離心10秒后在PCR儀上進行擴增實驗。  

3. PCR擴增（擴增及產物分析區）  

95℃預變性3分鐘；95℃變性10秒，58℃退火延伸30秒，35個循環，在58℃時收集熒光信號。熒光第一通道選擇FAM（CHD-W基因），第二通道選擇VIC/HEX（內源性內參基因）（使用ABI系列實時熒光定量PCR儀，若有需求可提前聯系廠家或自行添加ROX校正染料；否則參照正常程序進行）。   

4. 結果判定  

4.1 陽性對照FAM通道和VIC/HEX通道的Ct值均＜28且出現“S”型擴增曲線，陰性對照無Ct值或Ct值≥35且無“S”型擴增曲線，實驗結果有效；否則應重新進行實驗，如重測實驗仍無效，請與廠家技術人員聯系。  

4.2 樣本VIC/HEX通道的Ct值應≤30且出現“S”型擴增曲線，表明樣本提取和擴增有效；如VIC/HEX通道無Ct值或Ct值為30＜Ct≤35，表明樣本核酸提取不達標或存在較強抑制干擾物（如酒精等消毒劑、抗凝劑等殘留）抑制擴增，建議重新處理樣本進行核酸提取及擴增；  

4.3 樣本VIC/HEX通道檢測有效后，再進行FAM通道的判定：  

Ct值≤30且出現“S”型擴增曲線，且兩通道Ct差值小于5，判定為CHD-W基因陽性，表明樣本來源于雌性；  

Ct值≤30且出現“S”型擴增曲線，但兩通道Ct差值≥5，或Ct值為30＜Ct＜32，則均判定為可疑，建議進行復測（建議先排除環境氣溶膠污染導致的“假陽性”結果，再重新進行核酸提取及檢測），如排除氣溶膠污染后FAM通道復測Ct值＜30，且有明顯的擴增曲線，兩通道Ct差值小于5，判定為CHD-W基因陽性，否則判定為陰性；  

無Ct值或Ct值≥32且無“S”型擴增曲線，判定為CHD-W基因陰性，表明樣本可能來源于雄性。  

注意事項：  

1）為了防止污染，實驗需要嚴格進行分區操作，分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成交叉污染。實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。PCR結束后，切勿立即開蓋，充分冷卻后再開蓋取樣，最大程度避免氣溶膠污染。  

2）試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融。試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求進行操作。操作臺、離心機及移液器等儀器應定期使用含氯消毒劑、消毒酒精、核酸污染清除劑或紫外燈進行消毒。  

3）檢測結果為陰性，并不完全代表為雄性，核酸樣本發生未知突變、質量不合格、載量過低、存在較強干擾抑制物導致核酸提取（檢測）不成功亦會產生“陰性”結果。本試劑盒僅用于鸚鵡中CHD-W基因的特異性擴增，涉及的其他產品請詳詢生產廠家。  

4）本品為一次性用品，試劑中的組分對于自然光較為敏感，分裝及保存時注意遮光，請勿反復凍融，僅供科學研究，不用于臨床診斷等其他用途。